doi: 10.1016 / j.jsb.2010.11.021.

En ligne du 3 déc.2010.

Benjamin W Neuman
1
,
Gabriella Kiss, Andreas H Kunding, David Bhella, M Fazil Baksh, Stephen Connelly, Ben Droese, Joseph P Klaus, Shinji Makino, Stanley G Sawicki, Stuart G Siddell, Dimitrios G Stamou, Ian A Wilson, Peter Kuhn, Michael J Buchmeier

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Benjamin W Neuman et al.

J Struct Biol.


.

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Abstrait

La protéine M du coronavirus joue un rôle central dans l’assemblage du virus, transformant les membranes cellulaires en ateliers où les facteurs du virus et de l’hôte se réunissent pour former de nouvelles particules virales. Nous avons étudié comment la structure et l’organisation de M sont liées à la forme et à la taille du virus en utilisant la microscopie cryoélectronique, la tomographie et l’analyse statistique. Nous présentons des preuves qui suggèrent que M peut adopter deux conformations et que la courbure de la membrane est régulée par un conformère M. La protéine M allongée est associée à la rigidité, aux grappes de pointes et à une plage de courbure de membrane relativement étroite. En revanche, la protéine M compacte est associée à la flexibilité et à une faible densité de pointes. L’analyse de plusieurs types de particules et de virions pseudo-viraux a révélé que la protéine S, la protéine N et l’ARN génomique aident chacun à réguler la taille et la variation des virions, probablement par le biais d’interactions avec M. Ces résultats donnent un aperçu du fonctionnement de la protéine M pour favoriser l’assemblage du virus.

Copyright © 2010 Elsevier Inc. Tous droits réservés.

Les figures

Figure 1

Figure 1. Particules et vésicules de coronavirus dans la glace vitreuse

Des micrographies cryoélectroniques de petites vésicules unilamellaires (A), des particules de type MHV (B), trois coronavirus (C) et une tomographie cryoélectronique du MHV (D) sont présentées. Le diamètre visible le plus long et le plus court de chaque particule a été mesuré, comme indiqué dans le panneau A. Les particules virales se distinguaient des exosomes vides par l’épaisseur de l’enveloppe. Une particule sans pointes (*) et des enveloppes virales libres (e) sont marquées. Les particules d’or qui ont été utilisées comme marqueurs fiduciaires dans la construction du tomogramme sont marquées de flèches.

Figure 2

Figure 2. Identification de M et de ribonucléoprotéine dans les particules virales

(A) Une enveloppe virale modèle explique les caractéristiques d’une particule MHV en comparant les moyennes (B) de ~ 20 distributions de densité radiale de particules de type virus MHV, de virions apparemment appauvris en pointes, de virions normaux et de vésicules exosomales vides. (C) Les caractéristiques individuelles sont cartographiées sur le modèle de densité radiale des vésicules vides comme suit: la protéine M (bleue) est révélée comme la différence entre EM VLP et vésicules, S (rouge) est la différence entre les virions normaux et sans pointes et la ribonucléoprotéine est la différence entre EM VLP et virions sans pointes. (D) Des différences dans la cohérence de l’organisation du noyau et de l’enveloppe sont révélées à partir de l’écart-type des diagrammes de densité radiale de 40 MHV.

figure 3

Figure 3. Preuve de deux formes de protéine M dans les virions

M en forme de tige distincteLONGUE les caractéristiques peuvent être vues au bord des images cryo-EM du MHV EMN VLP (A) et coronavirus félin (B-F). Les régions où M apparaît indistinct, compact et ne semble pas entrer en contact avec la ribonucléoprotéine au bord des particules sont marquées par des flèches courbes. Les régions de la membrane qui ressemblent à des bicouches lipidiques sans protéines (D, encart et G) sont marquées d’une double ligne. Agrandissements de MLONGUE (E), MCOMPACT (F) et une vésicule (G) sont illustrées ci-dessous. Les cartes de densité radiale (H) et M rapports queue / corps (I) sont illustrés pour illustrer la différence d’apparence entre MLONGUE et MCOMPACT de trois coronavirus.

Figure 4

Figure 4. Vues des bords du M emballé

Des moyennes de classe sans référence ont été faites à partir de groupes de 300 à 2000 images découpées sur les bords des particules virales. La correction de la fonction de transfert de contraste complet à travers une résolution de 17 Å a été mise en œuvre pendant la reconstruction moyenne de la classe. Les moyennes des classes de vue de bord indiquent MLONGUE (A, en haut) et MCOMPACT (A, en bas) de MHV EMN VLP. Exemples de moyennes de classe montrant MLONGUE de EM Les VLP et les virions sont présentés dans le panneau B. Le panneau C montre les projections bidimensionnelles de l’ectodomaine M, du domaine transmembranaire et de l’endodomaine sous forme d’ellipsoïdes avec la largeur de MLONGUE à partir des moyennes de classe et du volume prévu de 1, 2 ou 3 copies de protéine M (à droite).

Figure 5

Figure 5. Association de MLONGUE avec membranes convexes décorées de pointes

Les panneaux A et B représentent des enveloppes virales libres trouvées dans les tomogrammes MHV. Des projections à travers des sous-programmes épais (50 nm) et minces (1 nm) sont présentées pour comparaison. Des régions plus épaisses de la membrane attribuées à MLONGUE sont marquées en noir et les régions plus minces attribuées à MCOMPACT sont marqués en blanc. Des pointes visibles sont marquées de cercles pour démontrer la topologie de la membrane et des virions intacts (V) sont également indiqués.

Figure 6

Figure 6. Organisation de M

De petites zones qui semblent montrer des vues axiales de petits groupes de protéines M organisées sont marquées dans les images des VLP (A) et agrandies en dessous (B, à gauche). Des moyennes de classe sans référence ont été établies à partir de groupes de 1 500 (EM) ou 3000 (EMN) images coupées des centres VLP. La correction de la fonction de transfert de contraste complet à travers une résolution de 17 Å a été mise en œuvre pendant la reconstruction moyenne de la classe. Les dimensions des cellules unitaires sont d’environ 4 nm (a) par 4,5 nm (b), avec un angle intérieur de 75 °. (C) Espacement moyen des dimères M mesuré par diverses méthodes.

Figure 7

Figure 7. Relation entre la conformation M et la forme des particules

(A) Le rapport du diamètre le plus long au plus court des particules de coronavirus des micrographies MHV, SARS-CoV et FCoV et des tomogrammes MHV est tracé par rapport au pourcentage de particules qui avaient au moins une région anormalement mince de membrane. Chaque point de données présente la moyenne de 20 particules de forme similaire. (B) Les boîtes étaient centrées sur la membrane à chaque extrémité (étoiles) et côté (cercles) de soixante-dix particules du SRAS-CoV pour examiner la relation entre la forme M et la courbure de la membrane. (C) Le rapport de MLONGUE à MCOMPACT est tracé en fonction de la forme moyenne des particules. Chaque point de données représente deux côtés ou extrémités de quatorze particules de forme similaire. (A, C) Les courbes ont été ajustées par régression logistique.

Figure 8

Figure 8. Conversion entre MLONGUE et MCOMPACT

Le MHV purifié a été imagé par cryo-EM après incubation à pH 7 (A), ou une impulsion de 5 minutes à pH 5 suivie d’une re-neutralisation à pH 7 (B). Les flèches du panneau B pointent vers les bords aplatis de la particule avec l’apparence de MCOMPACT. La proportion de virions plats avant et après acidification est indiquée dans le tableau (C). Les cartes de densité radiale (D) et M les rapports queue / corps (E) des régions altérées du MHV acidifié, des VLPs EM natifs et des VLPs EMN natifs sont présentés aux côtés du MHV MLONGUE et MCOMPACT données de la figure 3h-i.

Figure 9

Figure 9. Relation de la protéine S à la morphologie

(A) Le rapport du plus long au plus court diamètre des particules de coronavirus des micrographies est tracé par rapport au pourcentage de particules qui avaient moins de la moitié du nombre attendu de pointes visibles au bord des particules. Chaque point de données représente la moyenne et l’écart type pour un groupe de 20 particules de taille similaire. Les courbes ont été ajustées par régression logistique à des ensembles de données dans lesquels l’association entre la décoration des pointes et la taille était statistiquement significative (ANOVA, P = 6,71 × 10-8 pour FCoV et 0,046 pour MHV). (B) Les particules du SRAS-CoV ont été classées selon la forme et la distribution des pointes. Les trois catégories de formes se réfèrent aux particules avec MAX/MIN moins de 1,1 (rond), 1,1 à 1,4 (légèrement ovale) ou supérieur à 1,4 (allongé). Le nombre de particules de chaque type qui ont été classées est répertorié.

Figure 10

Figure 10. Interprétation de la structure et de l’assemblage du coronavirus

(A) Une coupe schématique d’une particule allongée de SARS-CoV (taille ≈ 85 nm, MAX /MIN ≈ 1.4) montre comment les interactions entre MLONGUE (noir), MCOMPACT (blanc) et la ribonucléoprotéine influencent la morphologie des particules. Les pointes sont représentées en rouge et les oligomères de protéines E en jaune. (B, C) Modèle pour la façon dont MLONGUE pourrait être liée à l’espacement des pointes et aux densités RNP en vue de bord (B) et en vue axiale (C). Les formes creuses marquent les points d’attache potentiels les plus proches pour une pointe supplémentaire ou une densité RNP. (D) Un organigramme présente un modèle pour le rôle de la conformation M dans l’assemblage. Un chemin supplémentaire suggère et explique comment la morphologie des particules peut être modifiée pendant la purification.

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